عربي

Sputnik V , J&J , Oxford/Astrazeneca لقاحات

مستوى المادة: متوسط ​​إلى متقدم

 مستوى وضوح الرسم: متوسط

مدة القراءة : من أربع إلى 6 دقائق

كيف تم صنعها

لطالما كانت الفيروسات الغدية ناقلًا ممتازًا لتوصيل جينات العلاج الجيني ومستضدات اللقاح لعقود (وهذا ما ندعوه منصة لقاح فيروسية معتمدة على الناقلات


• ما هي الفيروسات الغدية؟
• لماذا اخترناها لتطوير اللقاح؟
• كيف تم تصميم الجيل الأول من لقاحات الفيروسات الغدية؟
• يمكن أن يكون ظهور نسخ متماثلة للفيروس الغدي (RCA) مشكلة تتعلق بالسلامة في التصنيع المعتمد فما


تهدف هذه المقالة إلى توجيه القراء ، خطوة بخطوة ، إلى فهم أفضل لهذه التقنية

ما هي الفيروسات الغدية Adenovirus؟
تأتي كلمة “adeno” من الكلمة اليونانية “adēn” ، وتعني “الغدة”. في عام 1953 ، تم عزل الفيروس الغدي من الزوائد الأنفية لطفل وتمت الإشارة إليه على أنه “عامل تنكس غدي”، واختصاره إلى “AD agent” ( Rowe WP et al . )

عدوى الفيروس الغدي
تسبب الفيروسات الغدية حوالي 5-10٪ من أمراض الجهاز التنفسي. عادة ما تسبب التهابات الجهاز التنفسي بدون أعراض ولكنها يمكن أن تكون خطيرة ومميتة للأفراد الذين يعانون من نقص المناعة. العدوى الفيروسية الغدية ليست فقط في الجهاز التنفسي ولكن أيضًا في العين أو الجهاز الهضمي ويمكن أن تؤثر على مجموعة واسعة من العوائل (البشر والحيوانات).
• فترة الحضانة 3-10 أيام .
• عمليات إعادة التنشيط المحتملة في الأطفال والبالغين الذين يعانون من كبت المناعة.

التهاب البلعوم الحموي الحاد (الأطفال من سن 3 سنوات) ، حمى الملتحمة البلعومية (7-8 سنوات)
أعراض شبيهة بالإنفلونزا مثل: احتقان الأنف ، والسعال ، وضيق التنفس ، والشعور بالضيق ، والحمى ، والقشعريرة ، وآلام العضلات والصداع

أمراض الجهاز التنفسي الحادة (ARD) : الحمى ، والسعال ، والتهاب البلعوم ، والتهاب الغدة العنقية ، والأنماط المصلية 4 ، 7 • الالتهاب الرئوي الفيروسي ، التهاب الحنجرة والخناق والتهاب القصيبات.

المتلازمات السريرية في الحالات المثبطة للمناعة:
التهاب رئوي
التهاب الكبد / التهاب البنكرياس الخاطف
التهاب القولون / التهاب المعدة والأمعاء الخاطف
التهاب المثانة النزفي
التهاب الدماغ (نادر) http://www.labanalisibruno.it/files/adenovirus.pdf

التركيب
تحتوي جزيئات الفيروس الغدي على:
• قفيصة عشرينية الوجوه
• القطر 70-90 نانومتر
جسيمات الفيروس الغدي ليس لها غلاف دهني.

العائلة
Adenoviridae أكثر من 50 نمطًا مصليًا

الجينوم عبارة عن حمض نووي DNA خطي مزدوج الشريطة يتكون من 26-45 الف زوج قاعدي:
• تكرار طرفي مقلوب (ITR) (شكل ورود في صورة الجينوم ، أدناه)
• خمسة جينات متقدمة (E1A ، E1B ، E2 ، E3 ، E4) التي تعدل التعبير الجيني للمضيف المطلوب لتخليق البروتين الغدي وتضاعفه.
• خمسة جينات متأخرة (L1-5) مطلوبة لتجميع وتحرير وتحلل الخلايا المضيفة.

لماذا اخترناها لتطوير اللقاح؟ إيجابيات وسلبيات

  • الإيجابيات
  • لا تغزو نسيج واحد فقط ولكن عدة أنسجة
  • سهولة التلاعب الجيني
  • الخصائص المساعدة المتأصلة
  • القدرة على تحفيز الخلايا التائية القوية الخاصة بالجينات المعدلة واستجابات الأجسام المضادة
  • سهولة الإنتاج على نطاق واسع.
  • سلبيات
  • مناعة موجودة مسبقًا في البشر
  • – استجابات التهابية
  • عزل ناقلات في الكبد والطحال
  • ظهور نسخ متماثلة للفيروس الغدي (RCA) أو RCA الزائف
  • العديد من خطوات الإنتاج تزيد من احتمالية التلوث

عملية بناء ناقلات الفيروس الغدي AD agent
قبل التوليد

كما ذكر أعلاه: إن المناعة البشرية الموجودة مسبقًا ، والاستجابات الالتهابية ، وعزل الناقلات في الكبد والطحال قد حدت من استخدام الفيروسات الغدية كناقلات. ومع ذلك ، فإن اختيار الفيروسات الغدية الأقل انتشارًا والأقل عدوى في سكان العالم يمكن أن يحل هذه المشكلة. يستخدم Sputnik V الناقلين Ad26 و Ad5، ويستخدم J&J الناقل Ad26، ويستخدم Oxford / Astrazenca الناقل الفيروسي الشمبانزي (ChAdOx1).
تم تصميم فيروسات Adenovirus لجعلها آمنة وفعالة للاستخدام البشري كلقاحات وناقلات للعلاج الجيني.
إذا قمنا بتطعيم البشر بلقاحات تحتوي على ناقلات فيروسية غدية لا تزال قادرة على التضاعف (RCA) ، فقد يصبح هذا مصدر قلق للسلامة. خاصة في الأشخاص الذين يعانون من نقص المناعة والذين من المحتمل أن ينتهي بهم الأمر مع عدوى غدية مهددة للحياة ومميتة.

يقوم الجين الأول أولاً بنسخ بروتين E1A ، وهو بروتين ضروري لتكاثر الفيروس. ينشط بروتين E1A نسخ الجينات الفيروسية الأخرى المسؤولة عن تخليق الحمض النووي الفيروسي.

بمعنى آخر: لا يمكن إجراء النسخ الفيروسية الغدية بدون وجود الجين E1وأن يكون يعمل بكفاءة

لهذا السبب ، في الجيل الأول من النواقل الفيروسية الغدية ، تم تحضيرها عن طريق القضاء على جين E1 ( يظهر في الشكل أدناه باللون الأخضر) لسببين:
• لجعلها نسخة معيبة
• لإفساح المجال لتسلسل الجينات المعدلة (مثل Spike S من الفيروس SARS-CoV-2 ، باللون الأحمر).
يعمل هذا النموذج كوصلة انتقالية ليسمح بتكرار ناقل الفيروس الغدي.

ماذا تعني التكملة الانتقالية؟
تم تصميم Ad المحذ,ف منه جين E1 داخل كروموسوم خلية (مثل خلايا HEK293 ، 911 ، وغيرها) ، وبالتالي يستمر في مساعدة الفيروس على التضاعف دون أن يكون داخل هذا الناقل الجينوم الفيروسي الخاص به (مثل

BLUETOOTH-PAIR)

لسوء الحظ ، لا يستمر دائمًا بالعمل كـ BLUETOOTH-PAIR نظرًا لوجود احتمالات إعادة التركيب المتماثل التلقائي

بين ناقل الفيروس الغدي ومناطق E1 أثناء التضخيم داخل خلايا HEK293 (المنطقة الرمادية) ، مما قد يسمح بظهور ناقلات الفيروس الغدي (RCA) المختصة للنسخ!

ومع ذلك ، دفع التقدم العلمي الباحثين إلى إيجاد خدعة لطيفة. لقد استبدلوا الجزء المتماثل بتسلسلات أخرى PGK و HBV polyA (خلايا PER.C6 كمثال). الآن ، RCA نادر الحدوث جدًا.

Vaccini anti COVID-19

Vaccini mRNA “Fatti in Casa”: è Possibile?

https://www.facebook.com/groups/influenzasconosciuta/permalink/1814490115386152/

I vaccini Pfizer e Moderna #COVID19Vaccini sono vaccini a mRNA incapsulati in nanoparticelle lipidiche (LNP). 

* nota: NANO significa NANOmetro che è un miliardesimo di metro. Quindi, è l’unità di misura, NON ci si riferisce a chip digitale / elettrico!

Qui di seguito l’elenco ingredienti:

1) ingrediente attivo (mRNA)

2) lipidi

3) buffer (soluzione tampone)

4) saccarosio

Lo scopo di questo articolo è spiegare “l’ingrediente attivo” di questi vaccini che è la molecola di “mRNA“. 

Come funziona il vaccino?

Il vaccino funziona simulando un “attacco” da agente esterno al corpo. Quindi, il tuo sistema immunitario riceve e memorizza gli “antigeni estranei (non-self)” forniti artificialmente attraverso vaccinazione PRIMA che entrino nel corpo in modo naturale.

Antigene, cosa significa?

In questo gruppo abbiamo ne abbiamo già parlato altre volte. Vedi questo post ben illustrato (https://www.facebook.com/groups/influenzasconosciuta/permalink/1678367275665104/).

ANTIGENE = ANTIbodies GENErating. Quindi, QUALSIASI molecola che genera la risposta immunitaria è antigenica. Gli antigeni sono principalmente PROTEINE in natura, ma possono anche essere lipidi, RNA, DNA, polisaccaridi … ecc.

Tipi dei vaccini

i vecchi vaccini classici lavoravano sulla produzione di vaccini vivi attenuati rispetto a vaccini uccisi inattivati (la generazione x era l’ultima a ricevere questo tipo di vaccini).

D’altra parte, i millennial hanno colpi diversi (sintetizzati, inattivati, sub-unità … ecc.). Ora, l’mRNA rivoluziona tutto. La domanda che le persone fanno più spesso: 

PERCHÉ ORA mRNA MA NON 50 anni fa?

La risposta è semplice: l’RNA è una molecola fragile e instabile. Questo l’ha resa “una male” candidata per la produzione di vaccini. Una volta risolto il problema dell’instabilità, l’era della piattaforma fiorisce

DNA –> RNA –> Proteina

Come avevo spiegato in diversi post prima, la proteina Spike (S) del coronavirus SARS-CoV-2 (il virus che causa COVID-19) è stata identificata quale bersaglio ottimale per la produzione del vaccino.

Mentre aziende come Novavax hanno lavorato duramente per realizzare questa proteina spike come prodotto finale (altri racconti nei prossimi post), altre come Pfizer e Moderna si sono concentrate sullo sviluppo del pezzo di mRNA.

mRNA insegna alle cellule umane a produrre proteina spike.

Allora, da dove proveniva l’mRNA nel vaccino Pfizer o Moderna?   

La biologia molecolare è molto complicata. Non vorrei che si smetta di leggere rapidamente a causa della scienza arida in esso. Qui, vorrei semplificare il più possibile. Immagina solo l’mRNA come un vagone di un TRENO. I vagoni sono i nucleotidi U,A, G, e C.

Quando un RNA “esterno” (non auto) entra nella cellula, la cellula umana riconoscerà immediatamente alcuni strani cavalieri e avviserà il sistema immunitario di cacciarli. Ci sono voluti decenni per apprendere che il vagone U è quello piu’ facilmente riconosciuto, quindi i ricercatori hanno modificato il vagone U in “pseudo U[Ψ] (1-methyl-3’-pseudouridylyl).

Ψ: pseudo U

Questa è una modifica che “elude” con successo la risposta immunitaria, per dare tempo all’mRNA sconosciuto, una volta entrato nelle nostre cellule, di essere tradotto in proteina.

Un’altra importante modifica è stata quella di proteggere entrambe le estremità dell’mRNA dalla degradazione da parte degli enzimi cellulari.

L’analogo di 5’ cap può essere aggiunto sia post- o co-trascrizione. In generale, il metodo co-trascrizionale è più adatto ai processi industriali.

Per proteggere la fine dell’mRNA aggiungiamo, al messaggio, una coda poli(A) codificandola nel modello di DNA o utilizzando una poli(A) polimerasi.

Se si studiano le sequenze in mRNA Pfizer e Moderna, si potranno notare due cose:

  • 1)– la lunghezza della coda del poli(A) è diversa e
  • 2)– mentre Pfizer ha 2 codoni di stop, Moderna ne ha 3. 

Cosa sono i codoni di stop?

Cosa sono le altre parti all’interno delle sequences come Sig. UTR ecc?

CureVac è vaccino ad mRNA vaccino, pero è “piu naturale”, che significa? 

Continua …

****** Continua la prossima settimana ************

Per favore, se hai notato errori di battitura o grammaticali, fammelo sapere. GRAZIE!

https://github.com/NAalytics/Assemblies-of-putative-SARS-CoV2-spike-encoding-mRNA-sequences-for-vaccines-BNT-162b2-and-mRNA-1273/blob/main/Assemblies%20of%20putative%20SARS-CoV2-spike-encoding%20mRNA%20sequences%20for%20vaccines%20BNT-162b2%20and%20mRNA-1273.docx.pdf

(https://www.facebook.com/groups/influenzasconosciuta/permalink/1678367275665104/).

Vaccini anti COVID-19

Sputnik V, J&J ed Astrazeneca/Oxford #COVID19vaccini: Come Sono Stati Realizzati

 ENGLISH ABSTRACT

Adenoviruses have been excellent vectors for delivering genes for gene therapy and vaccine antigens for decades. This is what we know as a viral vector-based vaccine platform; VV-based).

  • What are adenoviruses?
  • Why did we choose them for vaccine development?
  • How was the first generation of adenovirus vaccines designed?
  • RCA can be a safety issue in VV-based vaccine manufacturing, what does this mean?

The aim of this article is to lead readers step-by-step to a better understanding of this platform. 

*****

Gli adenovirus sono stati per decenni ottimi vettori per il rilascio di geni per la terapia genica e antigeni dei vaccini (e questo è ciò che sappiamo come piattaforma vaccinale basata su vettori virali; VV-based).

  • Cosa sono gli adenovirus?
  • Perché li abbiamo scelti per lo sviluppo dei vaccini?
  • Come è stata progettata la prima generazione di vaccini a base di adenovirus?
  • La RCA può essere un problema di sicurezza nella produzione basata su vv, che cos’è?

Questo articolo vuole portare i lettori, passo dopo passo, ad una migliore comprensione di questa tecnica. 

Cosa sono gli adenovirus?

La parola “adeno” viene dal greco “adēn”, e significa “ghiandola”. Nel 1953, l’ adenovirus è stato isolato dalle adenoidi di un bimbo e venne definito un “agente di degenerazione adenoide”, abbreviato in “A.D. agente” (Rowe WP et al.)

Infezioni da Adenovirus

Gli adenovirus causano circa il 5-10% delle malattie respiratorie. Di solito causano infezioni del tratto respiratorio asintomatiche, ma possono essere pericolosi e fatali negli individui immunocompromessi. Le infezioni adenovirali non sono solo respiratorie, ma anche oculari o gastrointestinali e possono colpire una vasta gamma di ospiti (uomini e animali). 

  • Periodo d’incubazione di 3-10gg
  • Possibili riattivazioni in bambini immunodepressi e adulti. 

Faringite febbrile acuta (bambini di 3 anni), Febbre faringo-congiuntivale (7-8 anni). 
Sintomi simili-influenzali quali: congestione nasale, tosse, coriza, malessere, febbre, brividi, mialgia e cefalea) 
Malattia respiratoria acuta (ARD): Febbre, tosse, faringite, adenite cervicale, sierotipi 4, 7 • Polmoniti virali, laringiti, croup, bronchioliti.

 
Sindromi cliniche nei soggetti immunodepressi:
Polmoniti 
Epatiti/pancreatiti fulminanti 
Coliti/gastroenteriti fulminanti 
Cistiti emorragiche 
Encefaliti (rare) (bel pdf: http://www.labanalisibruno.it/files/adenovirus.pdf)


La Struttura 
Le particelle degli adenovirus hanno: 

  • capside icosaedrico 
  • diametro di 70-90 nm 

Le particelle degli adenovirus non hanno involucro lipidico. 


Familia
Adenoviridae (piu’ di 50 sierotipi). 


Il Genoma è DNA lineare a doppio filamento di 26-45 kbp

  • Due ripetizioni terminali invertite (ITR) (rose nell’immagine del genoma, sotto)

 –  Cinque geni precoci (early) (E1A, E1B, E2, E3, E4) che modulano l’espressione genica dell’ospite richiesta per la sintesi e la replicazione della proteina dell’adenovirus.

  • Cinque geni tardivi (L1-5) che sono necessarie per l’assemblaggio, il rilascio e la lisi delle cellule ospiti. 

Perché li abbiamo scelti per lo sviluppo dei vaccini? Pros e Cons


Pros
– un’ampia gamma di tropismo tissutale
– facilità di manipolazione genetica 
– proprietà adiuvanti intrinseche, 
– capacità di indurre robuste cellule T transgene-specifiche e risposte anticorpali
– facilità di produzione su larga scala.


Cons 
– immunità preesistente nell’uomo,
– risposte infiammatorie,
– sequestro del vettore a fegato e milza
– l’emergenza di Replication-Competent Adenovirus (RCA) o pseudo RCA
– molte fasi di produzione aumentano la possibilità di contaminazione

Costruzione di vettori adenovirali
Prima generazione
Come menzionato sopra: immunità preesistente nell’uomo, le risposte infiammatorie, e – sequestro del vettore in fegato e milza hanno limitato l’uso degli adenovirus come vettori. Tuttavia, la scelta di adenovirus meno circolanti e meno infettivi nella popolazione mondiale può risolvere questo problema. Sputnik V usa Ad26 e Ad5. J&J usa Ad26. Oxford/Astrazenca usa Ad dello scimpanzé (ChAdOx1).  
Gli adenovirus sono realizzati per renderli sicuri ed efficienti per l’uso umano come vaccini e vettori di terapia genica. 
Se vacciniamo gli esseri umani con vaccini contenenti vettori adenovirali che hanno ancora la loro capacità di replicarsi (RCA), questo potrebbe diventare un problema di sicurezza. Soprattutto nelle persone immunocompromesse che probabilmente finirebbero con un’infezione adenovirale pericolosa e fatale. 
Il primo gene trascrive prima la proteina E1A, una proteina essenziale per la replicazione virale. La proteina E1A attiva la trascrizione di altri geni virali responsabili della sintesi del DNA virale. 

In altre parole: le copie adenovirali NON possono essere realizzate senza il gene E1 completamente funzionante.


Per questo motivo, nei vettori adenovirali di prima generazione sono stati preparati eliminando il geno E1 (verde) per due cose:

  • Per renderli difettosi nella replicazione e 
  • Per creare spazio per una sequenza transgene (come Spike S dal SARS-CoV-2, rosso).

Questo modello è funzionale come trans-complementazione e consente la replicazione del vettore adenovirale.

Trans-Complementazione che significa? 
L’E1 eliminato da Ad è ingegnerizzato all’interno del cromosoma della cellula (come HEK293, 911, ecc.), e quindi continua ad aiutare il virus a replicarsi senza trovarsi all’interno del proprio genoma virale (come BLUETOOTH-PAIR). (Vedi l’illustrazione).

Purtroppo, non continua sempre come BLUETOOTH-PAIR perché ci sono possibilità di ricombinazione omologa spontanea tra il vettore adenovirale e le regioni E1 durante l’amplificazione all’interno delle cellule HEK293 (zona grigia), che potrebbero consentire l’emergere di vettori adenovirali (RCA) competenti per la replicazione!


Tuttavia, il progresso scientifico ha portato i ricercatori a trovare un bel trucco. Hanno sostituito la parte omologa con altre sequenze come PGK e HBV polyA (PER.C6 cellule come un esempio). Ora, l’evento RCA è quasi molto raro che si verifichi.

Continua …

Era chiaro? E ben spiegato? Guarda cosa ha detto la gente

Vaccini anti COVID-19

Il Vaccino J&J NON è Lo Stesso come Sputnik ed AZ

https://www.facebook.com/groups/influenzasconosciuta/permalink/1796597677175396/

Leggo spesso che molte persone scrivono:

“Il vaccino J&J è lo stesso come Sputnik ed AZ”.

No, non è lo stesso. La differenza principale è che J&J esprime la protiena Spike MODIFICATA, mentre AZ e Sputnik non hanno modificato loro proteina Spike (S)

COSA SIGNIFICA?

Prima di tutto, cominciamo a capire pochi punti:

Perché la proteina Spike (ma nient’altro?)

La proteina spike S di SARS-CoV-2 è stata selezionata all’inizio come obiettivo per lo sviluppo del #COVID19Vaccino, sulla base dell’esperienza con SARS-CoV e MERS-CoV. S del coronavirus è nota per essere relativamente labile e, oltre a questa proprietà intrinseca, la spike SARS-CoV-2 contiene anche un sito di scissione polibasica tra S1 e S2.

Cosa è Il sito di scissione polibasica tra S1 e S2?

Il sito di scissione polibasica è un sito di escissione proteolitica utilizzato da proteasi cellulari che attivano un’ampia gamma di proteine ​​precursori. L’acquisizione di un sito di clivaggio polibasico (CS) è associata a patogenicità virale. Sono note anche varie proteasi cellulari come furina che catalizzano il processo di attivazione proteolitica per scindere varie proteine ​​della superficie cellulare virale, necessarie per l’ingresso virale nelle cellule ospiti.Nella ricerca dell’influenza virus, i ricercatori hanno notato che la rimozione dei siti di scissione polibasica ha dimostrato di stabilizzare le proteine dell’emoagglutinina (HA) dei virus influenzali altamente patogeni.Il lavoro su SARS-CoV-1 e MERS CoV aveva dimostrato lo stesso. Non solo così ma anche che l’introduzione di due proline (+PP) nelle posizioni 986 e 987 del SARS-CoV-2 migliora la stabilità e l’espressione.

Sito di scissione polibasica in SARS-CoV-2

La proteina spike svolge un ruolo fondamentale nel legare il virus al recettore della cellula ospite (enzima di conversione dell’angiotensina 2, ACE2) e successivamente nel mediare l’ingresso virale attraverso la fusione della membrana. La furina riconosce un sito di scissione polibasica e scinde la proteina spike durante l’ingresso del virus negli endosomi. Il sito di scissione polibasica viene generato come risultato dell’inserimento di 12 nucleotidi, che successivamente si traduce nella prevista acquisizione di 3 glicani intorno al sito. Questa particolare caratteristica non è presente nelle proteine ​​spike di altri coronavirus, inclusi il coronavirus di pipistrello e SARS-CoV.

Come i ricercatori hanno usato questa characteristica per studiare l’effetto degli elementi stabilizzanti su l’immunogenicità della proteina spike?

Molti studi in quest’area, compresi quelli che utilizzano versioni mutate di SARS-CoV-2 con siti di clivaggio polibasico PRAR cancellati (ΔCS) o mutati con due proline (+PP).

Questo funziona perché la **Prolina è un amminoacido molto solido. È un po **come una stecca** che stabilizza la proteina nella condizione di cui abbiamo bisogno per mostrare il sistema immunitario.

É stata ipotizzata che la rimozione del sito possa rendere la proteina più stabile in vivo dopo la vaccinazione (Krammer F, et al. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33653892/). Una stabilità più lunga potrebbe portare a risposte immunitarie più forti e potenzialmente più uniformi. La combinazione dell’eliminazione del sito di scissione polibasica e dell’introduzione delle mutazioni PP (ΔCS+PP) ha dato i migliori risultati.

Allora, non tutti i vaccini sono “tecnicamente” uguali, giusto?

Si. Non sono uguali. I candidati vector-virali vaccini: ChAdOx sviluppato da AstraZeneca e Sputnik V utilizzano una versione wild type (non-modificata) della proteina spike, mentre il vaccino mRNA di Moderna e Pfizer usa un costrutto di spike che include le mutazioni PP ma presenta un sito di clivaggio wild-type.J&J e Novavax utilizzano un costrutto spike ricombinante ΔCS+PP.